近年来，基因治疗技术发展迅速，特别是随着以CRISPR为代表的基因编辑技术的进步，人类最终战胜了遗传病带来了无限的希望。 线粒体(mitochondrion )是细胞的“能量工厂”，线粒体内有独立于细胞核的遗传物质——线粒体DNA (mtDNA )，人mtDNA长16569bp，具有37个基因。 mtDNA变异可带来母系遗传Leigh综合征、线粒体肌病、Leber遗传性视神经疾病、互助失调舞蹈病、骨骼肌溶解症等数十种遗传疾病。 据统计，5000名成人中至少有一人患有线粒体遗传病。
但是，不可能的CRISPR基因编辑似乎对线粒体遗传病无能为力。 强大的CRISPR技术对线粒体基因组无力的原因主要有两点：线粒体基因组相对较小，人的mtDNA为16569bp，缺乏足够的CRISPR可编辑部位。 另外，CRISPR基因编辑必须依赖gRNA发挥作用，但目前还没有有效的将外源RNA导入线粒体内的有效方法。 线粒体基因变异引起难以治愈、致死性严重的疾病，因此线粒体基因编辑工具的开发是线粒体遗传学领域的长期目标。 面对这个难题，在基因编辑领域屡有重大突破的刘如谦(David Liu )再次出手。
2020年7月8日，刘如谦团队在国际顶级学术期刊Nature杂志上发表了题为“Abacterial Cytid INEDINEDEAMINASEINABESCISPR-Freemito Chondrial baseediting”的研究论文研究小组发现并命名了双链DNA (dsDNA )中胞嘧啶脱氨，将胞嘧啶(c )转化为尿嘧啶(u )的细菌毒素—— DddA。 DddA分裂半体、转录激活子样效应器阵列蛋白(TALE )和尿嘧啶糖化酶抑制剂融合，产生由无RNA的DDA衍生的胞嘧啶碱基编辑器(DdCBE )，能催化人mtDNA中的C吗？ 从g到t？ 由于a的转化，具有很高的目标特异性和编辑正确性。
这个不依赖CRISPR的碱基编辑器——DdCBE实现了线粒体基因组(mtDNA )的精确编辑，带来了线粒体遗传病的研究和线粒体遗传病的治疗前所未有的工具。 这也是刘如谦继单碱基编辑(base Editor )和先导编辑(Prime Editor )之后在基因编辑领域取得的另一大突破。 哥伦比亚大学的线粒体疾病研究专家Michio Hirano认为这是一个“非常聪明”的战略，说“听说了线粒体研究领域的圣杯”。
2018年，华盛顿大学Joseph Mougous教授实验室的博士后Marco de Moraes在实验中偶然发现了细菌毒素——DddA。 这种毒素可以用DNA双链把胞嘧啶(c )转换成尿嘧啶(u )。 这是前所未有的。 Joseph Mougous教授决定与开发单碱基编辑技术的刘如谦团队合作。 合作时，两个团队发现DddA与单碱基编辑器相比没有明显的优势。
这促使研究小组改变研究方向，然后麻省理工大学的线粒体功能障碍专家Vamsi Mootha参加了研究小组。 为了将细菌毒素——DddA应用于线粒体基因编辑，首先，DddA是胞嘧啶脱氨酶，对哺乳动物细胞有毒，不能直接使用。 因此，研究小组把DddA蛋白分割成惰性的两部分，称为split-DddAtox halves。 然后，使这一半的DddA与TALE蛋白融合，结合。 人工设计的TALE蛋白可以与特定的DNA分子结合。 两个TALE与线粒体DNA (mtDNA )结合后，原来分解为一半的DddA再次聚集，催化剂碱基编辑的活性恢复了。 接下来，为了把这个基因编辑工具送到线粒体基质，必须通过线粒体的双层膜。
因此，研究小组对使用线粒体目标信号氨基酸序列构建的基因编辑工具进行了标记。 对线粒体双层膜来说，该基于蛋白质的导入机制优于基于RNA的导入系统(如CRISPR-Cas9 )。
第三，DddA是将胞嘧啶(c )转换为尿嘧啶(u )，已知u是RNA特有的碱基，u与DNA中的胸腺嘧啶(t )对应，具有相同的碱基对特性，但毕竟是RNA，u出现在DNA上就容易了。
因此，研究小组融合了TALE-DddA分裂半体和尿嘧啶糖化酶抑制剂(UGI )。 这样可以保护u免受糖基化酶的侵害，直到发生下一个DNA复制或修复。 此时，互补链的鸟嘌呤(g ) (编辑前与c配对)被腺嘌呤(a )置换，通过添加UGI，编辑效率提高了约8倍。 最终，研究小组构建了由线粒体靶信号肽、TALE蛋白、DddA分裂半体和尿嘧啶糖化酶抑制剂(UGI )组成的DddA诱导的胞嘧啶碱基编辑器(DdCBE )。
实验证明，该编辑工具能有效导入人细胞线粒体，准确编辑线粒体基因(mtDNA )，能催化人mtDNA的C。 从g到t？ a转换的编辑效率为5%—50%。 编辑效率受到各种因素的影响，如两个DdCBE子单元之间的间隔、TALE的设计、分离的DddA分裂半体的方向、目标胞嘧啶相对于TALE结合部位的位置等。
另外，研究小组验证了该线粒体基因编辑工具有无通过脱靶编辑细胞核基因组，研究小组比较了使用该编辑工具的细胞和未使用的细胞，由于细胞核基因组没有产生脱靶作用，因此脱靶性低2018年9月，《Nature Medicine》杂志同期在线两篇研究论文，来自剑桥大学和迈阿密大学米勒医学院的研究小组分别使用ZFN技术和TALEN技术实现了小鼠线粒体突变基因的去除。
线粒体基因组编辑修正了体内致病性mtDNA变异
MitoTALEN降低突变体mtDNA的负载量，恢复异质mtDNA变异小鼠模型中的tRNAAla水平。 但是，两项研究都是通过发生DNA双链断裂，线粒体DNA分解，减少有害变异，但在高变异负荷下，线粒体DNA的拷贝有可能下降到有害水平。
对此，刘如谦团队开发的线粒体碱基编辑工具——DdCBE可以减少具有突变的线粒体DNA的比例，而不减少线粒体的拷贝数。 因此，在线粒体突变负荷高的情况下，DdCBE有可能优先，也是唯一的选择。 线粒体基因变异导致母系遗传Leigh综合征、线粒体肌病、Leber遗传性视神经疾病、互助失调症、骨骼肌溶解症等数十种遗传疾病，这些疾病无法治愈，经常非常严重。
另外，几乎所有的线粒体现在都传给了孩子，有线粒体遗传病的女性想生健康的孩子，但线粒体移植只产生所谓的“三亲宝宝”。
据刘如谦团队统计，该线粒体编辑工具可修复49%的已知线粒体有害基因变异。 这个工具的发明给线粒体遗传病的研究、治疗和预防带来了前所未有的希望。
另外，线粒体作为细胞的“能量工厂”，线粒体基因组与人类老化、癌症和其他复杂疾病有着密切的关系，DdCBE的出现，为相关研究带来了新的工具。
