探讨载锰焦糖碳纳米球（Mn-CNS）在乳腺癌同步体内MRI与光热治疗中的应用价值。锰焦糖碳纳米球在肿瘤方面有什么价值？接下来，天医网小编就带你了解一下吧！
方法
采用无水葡萄糖作为碳源制备焦糖碳纳米球（CNS），表面吸附Mn2+制得Mn-CNS。在pH=7.4、6.0、5.0的超纯水体系中分别配制锰浓度依次为0、0.14、0.28、0.57、1.14、2.28 mmol/L的Mn-CNS溶液，测定不同pH体系内Mn-CNS水溶液的MR信号值，得到弛豫率。评估Mn-CNS细胞毒性，病理检查评估系统毒性。采用电感耦合等离子体质谱分析人乳腺癌细胞（MCF-7）、人正常乳腺上皮细胞（MCF-10A）和人巨噬细胞对Mn2+的摄取。小鼠乳腺癌4T1细胞乳腺癌动物模型成功后，将小鼠采用数字表法随机分为4组，每组6只，分别采用瘤内注射生理盐水+近红外激光（NIR）、静脉注射生理盐水+NIR、瘤内注射Mn-CNS+NIR、静脉注射Mn-CNS+NIR。瘤内注射30 min、尾静脉注射12 h后，用808 nm激光持续照射肿瘤部位10 min，记录肿瘤部位的温度变化，观察各组相对肿瘤体积变化。通过小鼠尾静脉注射Mn-CNS（含Mn为4 mg/kg），分别在注射前、注射后15 min、30 min、1 h、2 h、3 h、4 h、12 h、24 h、48 h、4 d采集MRI图像。采用t检验比较Mn-CNS孵育前后，不同细胞内Mn2+量的变化及不同处理组的肿瘤体积差异。
结果
在pH=7.4、6.0、5.0的体系里，Mn-CNS弛豫率分别为5.42、3.48、0.18 L ·mmol-1·s-1。在25、50、100、200 μg/ml的Mn-CNS培养浓度内，4T1细胞活力均维持在90%以上。MCF-7、人巨噬细胞均摄取一定量的Mn2+，摄取前后的差异有统计学意义（P<0.05）；MCF-10A摄取后细胞内的Mn2+的量稍高于摄取前，但差异无统计学意义（P>0.05）。各组荷4T1瘤小鼠尾静脉、瘤内注射生理盐水后，光热治疗10 min，小鼠肿瘤温度升高，肿瘤内注射Mn-CNS组>静脉注射Mn-CNS组>静脉注射生理盐水组>肿瘤注射生理盐水组。光热治疗后，瘤内注射生理盐水组和Mn-CNS组的相对肿瘤体积差异有统计学意义（t=－2.724，P<0.05），静脉注射生理盐水和Mn-CNS组的相对肿瘤体积差异也有统计学意义（t=－5.193，P<0.05）。荷4T1瘤小鼠尾静脉注射Mn-CNS后，肿瘤的T1信号强度逐渐上升，4 h达到强化峰值，之后信号强度值保持稳定并在12 h略下降，而后逐渐降低至正常；肾脏T1信号强度变化趋势与肿瘤组织一致，强化程度高于肿瘤，而肝脏组织强化程度最低。
结论
Mn-CNS生物相容性高并可自降解，同步实现靶向MRI和精准光热治疗，在乳腺癌一体化诊疗中具有重要的价值。
乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤，随着纳米技术的发展，集生物医学成像和治疗于一体的多功能纳米材料研究备受关注[1,2]。多功能诊疗纳米体系在肿瘤靶向成像、精准治疗方面具有重要价值，推动了肿瘤诊疗一体化的发展[3,4]，但也面临着生物安全性、靶向性、成像和治疗效率等一系列问题和挑战[5,6,7]。笔者旨在探讨载锰焦糖碳纳米球（manganese-loaded caramelized carbonaceous nanospheres，Mn-CNS）在乳腺癌同步体内MRI与光热治疗中的应用价值。
资料与方法
一、Mn-CNS的制备及表征
取4 g无水葡萄糖溶于适量超纯水，转移至不锈钢高压釜中，180℃加热6 h，获得产物分别用无水乙醇和去离子水离心洗涤3次，离心速度为12 000转/min，离心半径9.6 cm，离心时间10 min，80℃烘箱中干燥4 h以上，获得焦糖碳纳米球（caramelized carbonaceous nanospheres，CNS）。CNS 100 mg分散在适量超纯水中，加入4 g四水合氯化锰并搅拌，再用无水乙醇和去离子水离心洗涤，80℃烘箱中干燥4 h制得Mn-CNS。Mn-CNS通过电子显微镜和透射电子显微镜进行表征，流体动力学半径和Zeta电位分布通过Malvern纳米粒度及电位分析仪分析，Mn2+浓度通过电感耦合等离子体原子发射光谱法测量。
二、细胞和试剂
人乳腺癌细胞（MCF-7）、人单核细胞（THP-1）、人正常乳腺上皮细胞（MCF-10A）和小鼠乳腺癌细胞（4T1）均由中国典型培养物保藏中心提供。MCF-7、THP-1和4T1细胞培养基为RPMI1640，添加10%胎牛血清（均购自美国Gibco公司）。MCF-10A细胞培养基为正常乳腺上皮专用培养基MepiCM（购自美国ScienCell公司）。佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯（phorbol myristate acetate，PMA）购自美国Sigma-Aldrich公司。
三、Mn-CNS体外MRI弛豫率、Mn2+释放率及光热性能测试
在pH=7.4、6.0、5.0的超纯水体系中分别配制锰浓度依次为0、0.14、0.28、0.57、1.14、2.28 mmol/L的Mn-CNS溶液。采用美国GE Signa HDX 3.0 T MR扫描仪采集T1弛豫时间数据，通过弛豫时间倒数（1/T1）与Mn浓度（单位为mmol/L）拟合获得弛豫率（r1）。10 mg Mn-CNS溶于碱性磷酸盐溶液（pH=7.4、6.0、5.0）不同时间（30 min、1 h、2 h、8 h、12 h、24 h）后，分别离心取等体积上清液检测Mn2+浓度，进一步获得Mn2+的释放率。不同浓度的Mn-CNS水溶液（0、50、100、200、400 μg/ml）用近红外激光系统（波长808 nm，北京凯普林光电科技有限公司）以功率为3 w/cm2的连续波长持续照射10 min，用红外热像仪（型号S6-a，上海热像机电科技股份有限公司）持续监测温度变化。以上实验均平行重复3次。
四、Mn-CNS的毒性实验
细胞毒性实验利用细胞增殖-毒性检测试剂盒（CCK-8）评估4T1细胞活力。将4T1细胞接种到96孔板（每孔7×103个细胞）。细胞贴壁后，加入10 μl Mn-CNS（浓度分别为0、25、50、100、200 μg/ml）与细胞孵育12、24、36、48 h；将不含Mn-CNS的细胞作为对照组。之后，每孔加入10 μl CCK-8，37℃连续培养40 min后，通过酶标仪（美国Molecular Devices公司）获得450 nm处的吸光度（A值）。每个时间点有5个平行的孔，未处理细胞的细胞活力被认为是100%。实验重复3次取平均值。
系统毒性实验通过HE染色观察6~8周龄健康雌性Balb/c小鼠（购于济南朋悦实验动物繁育有限公司）不同器官组织形态结构改变。通过小鼠尾静脉注射Mn-CNS（含Mn为4 mg/kg），在注射后第1天和第7天分别取5只小鼠获取主要器官（心、肝、脾、肺、肾），10%福尔马林固定，石蜡包埋，切片，HE染色。取另外5只健康小鼠尾静脉注射生理盐水作为对照。
五、Mn-CNS的细胞摄取
用100 ng/ml的PMA刺激THP-1细胞48 h，诱导其贴壁、分化为巨噬细胞。将MCF-7、MCF-10A和人巨噬细胞接种于6孔板（每孔5×103个细胞）中并培养24 h以定量分析Mn-CNS的摄取。然后，用1 ml碱性磷酸盐溶液或Mn-CNS（80 μg/ml）置换培养基，并将细胞再孵育4 h。最后，收集细胞，计数并在电感耦合等离子体质谱分析前溶解于王水溶液中3 d以上。每种细胞不同处理后均重复测量3次取平均值。
六、乳腺癌动物模型构建
6~8周龄的雌性Balb/c小鼠购于济南朋悦实验动物繁育有限公司。在小鼠后腿皮下种植4T1细胞（1×106）个，养育15 d，待肿瘤体积达到80 mm3时即可用于实验。
七、荷4T1瘤小鼠光热治疗
用荷4T1瘤小鼠进行体内光热治疗评估。将小鼠采用数字表法随机分为4组，每组6只，分别进行如下操作：（1）采用注射泵行瘤内注射生理盐水+近红外激光（near infrared laser，NIR）；（2）采用注射泵向瘤内注射Mn-CNS+NIR；（3）采用1 ml医用注射器经尾静脉注射生理盐水+NIR；（4）采用1 ml医用注射器经尾静脉注射Mn-CNS+NIR。注射Mn-CNS的剂量为（含Mn 4 mg/kg）0.1 ml；生理盐水为0.1 ml。
瘤内注射30 min、尾静脉注射12 h后，用808 nm激光（功率为2 w/cm2）持续照射肿瘤部位10 min，同时用红外热像仪记录肿瘤部位的温度变化。
光热治疗后，每组小鼠采用数字表法随机均分为2部分（每部分3只），一部分每隔1 d用游标卡尺测量每组小鼠皮下肿瘤最长径和最短径，并按公式计算肿瘤体积。肿瘤体积=肿瘤长径×肿瘤短径×肿瘤短径/2，相对肿瘤体积=肿瘤体积/小鼠光热治疗前肿瘤体积。肿瘤测量持续22 d，结束后采用颈椎脱臼法处死小鼠。另一部分在光热治疗2 d后，取出每组小鼠肿瘤组织，进行组织包埋、石蜡切片、HE染色，与对照组（未作任何处理的3只荷瘤小鼠）小鼠肿瘤组织HE染色结果比较，进一步评估肿瘤细胞凋亡、坏死情况。
八、荷4T1瘤小鼠的MRI检查
采用美国GE Signa HDX 3.0 T MR扫描仪、小动物线圈对荷4T1瘤小鼠进行MRI扫描。采用FSE序列行定量T1MRI，TR 700.0 ms，TE 16.6 ms，FOV 70 mm × 70 mm，层厚2 mm，无间距扫描，回波长度3，带宽12.5，矩阵320×256，采集次数2。通过小鼠尾静脉注射Mn-CNS（含Mn为4 mg/kg），分别在注射前、注射后15 min、30 min、1 h、2 h、3 h、4 h、12 h、24 h、48 h、4 d采集MRI图像。实验重复3次。
九、统计学方法
采用SPSS 17.0软件进行统计分析。Kolmogorov-Smirnov检验计量资料是否符合正态分布，符合正态分布的计量资料用
±s表示。采用t检验比较Mn-CNS孵育前后，不同细胞内Mn2+量的变化及不同处理组的肿瘤体积。P<0.05为差异有统计学意义。
