高产舍雷肽酶的粘质沙雷氏菌诱变选育
梅建凤1*, 蔡少芬1, 李靓2, 易喻1, 应国清1
1(浙江工业大学 药学院，浙江 杭州，310014) 2(浙江天科高新技术发展有限公司，浙江 杭州，310012)
摘 要 舍雷肽酶是一种来自粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的碱性蛋白酶，具有良好的抗炎和抗肿胀作用，应用于临床疾病的治疗已有多年。为了获得产酶活力高、传代稳定且不产灵菌红素的舍雷肽酶发酵生产菌株，以1株分离自家蚕(Bombyx mori)肠道，产舍雷肽酶的粘质沙雷氏菌LL-413为出发菌株，用紫外线和微波连续诱变，经过筛选，获得了2株产酶能力高，不产灵菌红素，且传代稳定的突变株MW-9和MW-14菌株，产酶活力分别达到982 U/mL和956 U/mL，是原始菌株的1.98倍和1.92倍。
关键词 舍雷肽酶；粘质沙雷氏菌；诱变育种；紫外线；微波
舍雷肽酶(serrapeptase，serratiopeptidase或serralysin)，又称沙雷肽酶、沙雷蛋白酶等，是一种碱性蛋白水解酶。该酶最初是从肠杆菌粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)E15中分离出的一种胞外酶[1-3]，因其强大的抗炎活性，被人们称之为“奇迹之酶”。舍雷肽酶具有良好的抗炎、抗肿胀、促进痰液、脓液溶解与排泄以及镇痛作用，临床用于手术后及外伤的消炎、副鼻窦炎、乳汁潴留性乳腺炎、膀胱炎、附睾炎、智齿周围炎及牙槽脓肿时的消炎，以及治疗支气管炎、肺结核、支气管哮喘时痰液不易咳出等[4-5]。早在19世纪70年代就在日本上市，随后在欧洲、亚洲等多个国家上市[6]，因出色的功效和无副作用，近年来，该酶作为辅助药物和保健食品市场需求旺盛。
舍雷肽酶主要由粘质沙雷氏菌发酵生产，目前主要生产国家是日本和印度，国内虽有一些企业在销售舍雷肽酶，但并非采用粘质沙雷氏菌发酵，而是采用枯草芽孢杆菌发酵，严格来说，此类产品不能称为舍雷肽酶。李靓[7]已从家蚕肠道中分离获得1株产舍雷肽酶的粘质沙雷氏菌，在优化的发酵条件下，酶活单位达到1 000 U/mL以上，但随着菌种的传代使用，产酶活力逐渐下降至500 U/mL左右。为了提高和稳定该菌株的产酶能力，实验采用紫外线和微波对该菌株进行连续诱变，筛选高产且传代稳定的舍雷肽酶突变菌株。
1 材料与方法1.1 材料与仪器
1.1.1 菌种
粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)LL-413菌株，从家蚕(Bombyx mori)肠道内分离，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC M2015780。
1.1.2 试剂与仪器
酪蛋白：生物试剂，百奥莱生物试品有限公司；酪氨酸：生物试剂，生工生物工程(上海)股份有限公司；福林酚试剂：分析纯，上海沪试化工有限公司；以及其他普通分析纯试剂或生物试剂。
紫外-可见分光光度计(UV2600型)，尤尼柯(上海)仪器有限公司；立式压力蒸汽灭菌器(LS-B50L型)，上海华线医用核子仪器有限公司；生化培养箱(SPX-250B型)，上海博迅实业有限公司；恒温培养摇床(HWY-2112型)，上海智城分析仪器制造有限公司；微波炉(G8023CTL-K3型)，中山格兰仕家用电器有限公司。
1.1.3 培养基
平板培养基(g/L)：麦芽浸粉12.2，牛肉膏6.6，酵母浸出粉11.0，NaCl 5.0，MgSO4·7H2O 1.0，琼脂20.0，pH 8.0，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。种子和产酶培养基除不加琼脂外，其他成分同平板培养基，250 mL三角瓶装50 mL种子或产酶培养基，8层纱布扎口，121 ℃蒸汽灭菌20 min。
1.2 方法
1.2.1 酶活的测定
采用Folin-酚法测定舍雷肽酶的活力[8]。发酵液离心后，上清液经过适当倍数稀释后待测，取1 mL酶液和1 mL酪蛋白溶液(20 g/L，pH 8.0的Tris-HCl缓冲液配制)于试管中，充分混合后于37 ℃水浴中保温10 min，再加入2 mL的三氯乙酸(TCA，0.4 mol/L)终止反应，继续水浴保温20 min，经8 000×g离心5 min。取1 mL上清液，加入5 mL的Na2CO3(0.4 mol/L)和1 mL福林酚试剂，37 ℃水浴保温显色30 min，以TCA灭活的酶液相同处理为参比，测定A660，依据酪氨酸浓度-A660标准曲线计算出酶解液中酪氨酸浓度，再按舍雷肽酶的活力定义计算发酵液中舍雷肽酶的活力。舍雷肽酶活力的定义：在37 ℃反应条件下，1 min水解质量浓度为20 g/L的酪蛋白产生1 μg酪氨酸的所需的酶量(mL)为1个酶活力单位(U/mL)。
1.2.2 菌种诱变
菌悬液的制备：取培养至对数生长期(16 h)的培养液1 mL，离心收集菌体，加入等量无菌生理盐水重悬菌体，再次离心收集菌体，重复2次。用100 mL无菌生理盐水重悬菌体于三角瓶中，加入1根无菌回形针于磁力搅拌器上搅拌20 min后备用。
紫外线诱变[9]：直径9 cm无菌培养皿7副，分别加入制备好的菌悬液2 mL。打开培养皿盖，在距离15 W紫外灯30 cm处边搅拌边照射，分别照射0、40、60、80、100、120、140 s。完毕后将各菌液用生理盐水稀释至103～105倍，取0.1 mL稀释菌液涂布平板，平板黑布包裹于30 ℃下培养24 h。
微波诱变[10]：微波炉高火预热和杀菌消毒5 min，5 mL菌悬液于试管中，试管于冰水浴中，在微波炉800 W的功率下处理0、40、60、80、100、120、140 s。完毕后将各菌液用生理盐水稀释103～105倍，取0.1 mL稀释菌液涂布平板，于30 ℃培养24 h。
1.2.3 菌株的初筛与复筛
初筛：选取致死率90%以上的平板，挑取菌落转接平板培养24 h后，挑取菌体接种产酶培养基(不做重复样)，30 ℃、200 r/min培养24 h，发酵液4 ℃、8 000×g离心5 min，测定上清液舍雷肽酶活力。
复筛：接种初筛获得的菌株菌体至种子培养基中，30℃、200 r/min培养24 h后，按5%的体积比接入产酶培养基，30 ℃、200 r/min培养24 h后测定舍雷肽酶的活力，每个菌株做3个重复。
1.2.4 传代稳定性试验
将诱变后的菌株以及原始菌株LL-413在平板培养基上传代培养，每代菌体都经过种子扩培和产酶培养(3个重复)，测定产酶活力，传代4次。
2 结果与分析2.1 紫外线诱变
2.1.1 紫外线诱变的致死率
测定粘质沙雷氏菌在30 ℃、180 r/min条件下的生长曲线，培养16 h进入对数生长的中期，制备的菌体经不同时长的紫外线照射，测得紫外线诱变的致死率见图1。
图1 紫外线照射对粘质沙雷氏的致死率
Fig.1 Fatality rate of Serratia marcescens irradiated by UV
由图1可以看出，随着紫外线照射时间的延长，致死率逐渐增加，当照射100 s时，致死率91.4%。一般认为致死率在90%～99.9%时，诱变效果较好[11]，所以从紫外线照射时长100 s以上诱变后的平板中挑取突变株。
2.1.2 紫外线诱变菌种的筛选
从紫外线照射时长100 s以上诱变后的平板中挑取突变株50株，诱变菌株产酶培养24 h后测定舍雷肽酶活力，从中选取酶活提高30%的10个突变菌株进行复筛，复筛的10个菌株产舍雷肽酶的活性见表1。
表1 紫外线诱变突变菌种的复筛产酶活力
Table 1 Serrapeptase activity of the strains after the 1st UV mutation in re-screening
经过复筛后，UV1-26、UV1-37和UV1-39菌株的产酶活力提高幅度较大，且均达到了极显著差异水平(p<0.01)，其中UV1-39突变菌株不产灵菌红素，菌落呈乳白色(图2)。不产灵菌红素菌株发酵生产舍雷肽酶，有利于提高酶产品的外观品质，在筛选产酶活力提高的前提下，优先选择此类突变株。
图2 UV1-39株紫外诱变菌株和出发菌株LL-413菌落形态
Fig.2 Colony morphology of strain UV1-39 and strain LL-413
2.1.3 二次紫外线诱变菌株的筛选
对复筛后的3株菌株再次用紫外线照射100 s，诱变后UV1-39为出发菌株长出的菌落均不产灵菌红素，UV1-26和UV1-37为出发菌株长出的菌落也有少数不产灵菌红素。从UV1-39平板中挑取了18株不产灵菌红素的突变菌株，产酶培养24 h后检测舍雷肽酶活力。从中选取产酶活力提高15%的6个突变菌株进行复筛，复筛的6个菌株产舍雷肽酶活力见表2。
表2 二次紫外线诱变突变菌种的复筛产酶活力
Table 2 Serrapeptase activity of the strains after the 2nd UV mutation in re-screening
从表2可知，UV2-6产酶活力提高幅度较大，且达到了极显著差异水平(p<0.01)，较其出发菌株UV1-39提高了18.1%，较原始出发菌株LL-413提高了37.9%，该菌株不产灵菌红素，所以选其作为进一步微波诱变的出发菌株。
2.2 微波诱变
2.2.1 微波诱变的致死率
以UV2-6为出发菌株，在设定微波功率为800 W的条件下，采用不同时长的微波辐射，测定微波诱变对粘质沙雷氏菌的致死率，结果见图3。
图3 微波辐射对粘质沙雷氏的致死率
Fig.3 Fatality rate of Serratia marcescens irradiated by microwave
随着微波辐射时间的增加，菌体死亡率不断的提高。辐射100 s时致死率为90.8%，所以从微波辐射时长100 s以上诱变后的平板中挑取突变株。
2.2.2 微波诱变突变菌种的筛选
从微波辐射时长100 s以上诱变后的平板中挑取突变株30株，摇瓶产酶培养24 h，测定各菌株产舍雷肽酶的活力，选取了产酶活力提高30%的10个菌株进行复筛，复筛的10个菌株产舍雷肽酶的活力见表3。可以看出，多数菌株产酶活力提高的幅度较大，且均达到了极显著差异水平(p<0.01)。产酶活力提高30%的菌株有7株，说明微波对粘质沙雷氏菌诱变提高舍雷肽酶的效果非常显著。
表3 微波诱变突变菌种的复筛产酶活力
Table 3 Serrapeptase activity of the strains after micro-wave mutation in re-screening
2.3 突变菌株的传代稳定性
将经微波诱变后的MW-4，MW-6，MW-7，MW-9，MW-11，MW-14，MW-21，与原始菌株LL-413一起在平板上划线培养，传代4次，且每代均做3个重复的摇瓶产酶培养，检测舍雷肽酶活力，结果见表4。
从表4以看出，原始菌株LL-413稳定性较好，产舍雷肽酶活力稳定；MW-4、MW-6、MW-11和MW-21菌株所产舍雷肽酶活力逐代下降；MW-9和MW-14两个突变菌株产酶活力稳定，分别为982 U/mL和956 U/mL，是原始菌株LL-413的1.98倍和1.92倍。
表4 突变菌株产舍雷肽酶活性的传代稳定性
Table 4 Hereditary stability of the mutant strains for producing serrapeptase
3 结论
从家蚕肠道中分离的原始菌株粘质沙雷氏菌LL-413，经紫外线和微波连续诱变后，筛选到2株产舍雷肽酶活力提高较大的突变株MW-9和MW-14，摇瓶发酵产酶活力分别为982 U/mL和956 U/mL，分别是原始菌株LL-413的1.98倍和1.92倍。目前，国内未见关于利用粘质沙雷氏菌产舍雷肽酶的研究报道；国外研究中，由粘质沙雷氏菌产舍雷肽酶活力最高报道是2 155 U/mL[12]。
此外，突变菌株MW-9和MW-14在30℃下培养均不产灵菌红素，发酵液不再是暗红色，这一特性有利于改善成品舍雷肽酶的外观颜色。
